为预防和治疗畜禽疾病，兽用抗生素被广泛用作饲料添加剂。在畜禽养殖业中，磺胺类是常用抗生素之一，大约占磺胺类抗生素总使用量的45%。所使用的抗生素在动物肠道中不能完全代谢，最终通过粪便和尿液排出体外进入到环境中。在畜禽养殖废水中，该类药物的检出浓度较高。抗生素的增加，使抗性基因在非致病和致病性细菌之间传播，会危害人类健康。
畜禽养殖场通常建有完整的生化处理工艺。但其不能有效去除抗生素，特别是磺胺类抗生素在尾水中仍保持高浓度，需另做处理再排放到环境中。由于人工湿地建设和维护成本低、操作简单、环境友好、污染物去除率高，因此被广泛应用于污水二级或三级处理，也是目前处理畜禽废水的常见工艺之一。垂直流人工湿地是人工湿地技术的主流工艺之一，其对污染物的去除效率及可承受的污染负荷都普遍高于表面流和水平潜流人工湿地，但抗生素会对垂直流人工湿地的运行处理状况产生负面影响。因此，在人工湿地中如何应对可能的抗生素影响，保障系统正常运行，实现抗生素和常规污染物的有效去除，需要做进一步研究。
铁碳微电解作为广泛使用的高级氧化技术之一，已被证明是一种高效处理制药废水、重金属废水、养殖废水和其他类型废水的低成本技术。铁碳微电解法是将一定比例的铁和碳浸入废水中而形成无数微小的原电池，废水作为电解质溶液产生氧化还原反应，对污染物进行氧化，从而使污染物分解为易降解物质。铁碳材料具有良好的吸附能力，在微电解和吸附的共同作用下，可以有效去除废水中的各种污染物。因此，有研究利用铁碳微电解技术对抗生素废水进行预处理，并取得了良好的效果。同时，有研究将微电解技术引入人工湿地后，发现其能有效应对农药等污染物的冲击，保证了人工湿地系统的稳定运行。
为了提高人工湿地系统对抗生素的适应性调整，笔者将铁碳微电解技术与人工湿地相结合，构建了微电解耦合上升垂直流人工湿地系统，同时构建普通上升垂直流人工湿地系统作为对照，研究两种人工湿地系统对畜禽养殖废水中磺胺二甲基嘧啶（SM2）的去除效果与净化机理，并通过酶活性测定和高通量测序系统分析了湿地系统中基质酶活性和微生物群落的变化，明确了磺胺二甲基嘧啶对两种人工湿地微生态系统的影响规律，旨在为畜禽养殖废水尾水中抗生素的去除探索有效途径。
1、材料与方法
1.1 实验装置
采用PVC材料制成两个尺寸相同的人工湿地实验装置（见图1）。装置长为70cm，宽为50cm，高为65cm。微电解耦合上升垂直流人工湿地系统（简称为A）自下而上依次填充鹅卵石（粒径为2~3cm）、铁碳（粒径为1~1.5cm）、沸石（粒径为0.5~1cm）；普通上升垂直流人工湿地系统（简称为B）自下而上依次填充鹅卵石（粒径为2~3cm）、砾石（粒径为1~1.5cm）、沸石（粒径为0.5~1cm）；并用铝箔包裹避光，在A、B系统的沸石层分别种植6株长势相似的美人蕉。植物生长补光灯日照时长为10h。
铁碳的制备参照文献，铁粉、碳粉、高岭土和氯化铵按照质量比为2.40∶3.60∶4.00∶0.05搅拌均匀后加水调匀，其含水率控制在10%~12%之间，采用球形造粒机制成粒径为1~1.5cm的球状填料，并在110℃的烘箱中干燥2h，将其放在马福炉中，在900℃下焙烧4h，自然冷却至室温后制成。
1.2 实验运行及采样
采用桂林市雁山在线亚洲精品自拍,精品乱码一区二区三四区视频出水启动系统，使用蠕动泵连续进水，HRT设置为48h，待两个系统中植物生长正常，且对常规污染物的去除率稳定运行至少一个月后视为启动完成，可开始后续实验。
用葡萄糖（400mg/L）、磷酸二氢钾（15mg/L）、三水合乙酸钠（54mg/L）、碳酸氢钠（111mg/L）、硫酸铵（108mg/L）、二水合氯化钙（30mg/L）配制成实验废水，进水COD、NH4+-N和TP平均浓度分别为（400.99±4.28）、（26.23±0.28）和（3.90±0.23）mg/L。采用连续流运行方式，每2d测定一次进出水中污染物浓度。选用磺胺二甲基嘧啶作为目标抗生素，其在模拟废水中的添加浓度设定为100μg/L。具体实验步骤分三个阶段，其中第一阶段为向A、B系统连续进实验废水两个月后，将湿地系统基质分为三等份，从基质上表面往下5~10、30~40cm两个范围设6个取样点，把所取基质放入无菌锥形瓶中，用无菌缓冲液淹没基质，充分振荡后，用0.22μm孔径滤膜过滤缓冲液，滤膜上的沉淀作为测试微生物多样性和基质酶活性的样品；继续向A、B系统进实验废水两个月（第二阶段），向废水中加入SM2并混匀，再次连续进水两个月后，提取基质，测试微生物多样性和基质酶活性（第三阶段），提取方法与第一阶段相同。
1.3 分析项目及方法
COD采用重铬酸盐法测定，NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定，TP采用钼酸铵分光光度法测定，TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定。
水样中的SM2采用HLB小柱净化富集，结合高效液相色谱法（HPLC）进行分析，具体操作如下：取300mL水样用0.45μm水系滤膜抽滤，然后用盐酸调节pH为3.0，加入0.3g的Na2EDTA；HLB小柱用5mL甲醇、5mL超纯水预洗，将备用水样过柱，以5mL/min的流速流经HLB小柱，挤干；用10mL甲醇洗脱，收集；用氮气吹干，加入1mL流动相旋涡溶解，过0.22μm滤膜，随后用于HPLC分析。色谱条件：色谱柱为AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相乙腈（A）∶0.1%甲酸（B）为15∶85，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，检测波长为270nm。
脲酶活性采用靛酚蓝比色法进行测定；脱氢酶活性采用TTC比色法进行测定；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法进行测定。微生物DNA提取采用FastDNASPINKitForSoil（MPBiotechnology）试剂盒来完成。PCR扩增所用的引物为338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGAC TACHVGGGTWTCTAAT），利用IlluminaMiSeq250仪器完成测序分析，测序由上海派森诺生物科技有限公司来完成。使用Vsearch软件过滤高质量的嵌合序列。采用UPARCE以97%的序列同一性对操作单元（OTU）进行聚类。
2、结果与讨论
2.1 污染物去除效果
进出水中COD、NH4+-N、TP和TN浓度的变化见图2。A系统对常规污染物的去除率显著高于B系统。第一阶段，A系统对COD、NH4+-N、TP和TN的去除率分别为（93.74±7.46）%、（70.79±3.67）%、（90.50±13.78）%和（62.86±4.07）%，而B系统的相应去除率分别为（67.27±7.71）%、（55.10±4.23）%、（61.94±8.23）%和（47.47±4.71）%。在第二阶段发现，提取基质后对两种湿地系统中微生物群落均造成了影响。对于外界影响，Ａ系统可以更快地调整适应，所以历经较短时间就恢复了高效处理能力；而B系统抵抗外界影响的能力较弱，去除率波动较大。第三阶段，A系统对几种常规污染物的去除率与第一阶段几乎相同，总体保持了稳定且高效的处理效果；B系统对常规污染物的去除率下降较明显且波动较大，COD、NH4+-N、TP和TN分别平均下降了3.80%、14.94%、30.97%和10.63%。这一过程表明在SM2的胁迫下，微电解耦合上升垂直流人工湿地系统可以稳定且有效地去除常规污染物，而普通上升垂直流人工湿地系统则受到了较大的冲击。
进出水中SM2浓度的变化如图3所示。
从图3可知，与B系统相比，A系统出水中SM2浓度更低，系统稳定运行后对SM2的去除率为（76.64±2.04）%，且能在10d左右达到稳定，而B系统对SM2的去除率为（36.37±19.45）%，且一直处于波动状态，50d后依旧难以稳定。因此，从对SM2的去除效果来看，A系统不仅在去除率方面优势明显，而且系统的稳定性也显著强于B系统，这也显示了B系统缺乏应对SM2冲击的能力，在相对较高浓度SM2的长期胁迫下难以实现稳定运行。
2.2 基质酶活性的变化
基质酶在污水净化中起关键作用，其是微生物分泌的一类非常重要的生物催化剂，能参与多种有机物反应，进而提高人工湿地系统对污染物的去除效率。其中脲酶、磷酸酶和脱氢酶与污水中氮、磷和有机物的去除密切相关。在模拟废水中投加SM2后，A、B系统中基质酶活性的变化见表1。
总体来看，A、B系统在投加SM2后，各项酶指标均有下降，表明SM2作为一种广谱性抗生素对微生物群落的影响是明确的。在A系统中脲酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性的变化率显著低于B系统。铁碳微电解可有效降解磺胺类抗生素的作用机理已有报道，推测微电解首先作用于S—N键，使其断裂，然后分别作用于苯环和特征官能团，得到一系列最终产物和中间产物。铁碳对SM2的分解作用能够大幅降低其对A系统的毒性胁迫，这在很大程度上保障了系统的原有功效。B系统则缺乏有效的应对机制，受到较高浓度SM2的冲击时微生物种群受到较大程度的影响，导致脲酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性大幅度降低，系统对常规污染物的去除效果下降得也比较显著。
A系统中，位于上层的沸石层酶活性的变化率略小于下层的铁碳层。图4为A系统中不同基质层SM2浓度的变化。可知，A系统中，SM2在铁碳层和沸石层的平均浓度分别为67.23和31.96μg/L，表明铁碳层确实降低了SM2浓度。因此，上层沸石层的SM2浓度更低，上层中微生物受到的影响也更小，体现出来的酶活性的变化率也更小一些。
2.3 微生物群落的变化
图5为A、B系统在属水平上的微生物Heatmap图（1为投加SM2前，2为投加SM2后）。
从图5可以看出，投加SM2前，A系统的主要优势菌属分别为Trichococcus和Bacillus。投加SM2后，A系统中以去除常规有机污染物为主的主要优势属Trichococcus的丰度（5.28%）降低至0.31%，而OPB41的丰度由7.12%升高至10.20%，此外Cloacibacterium的丰度（0.02%）升高至19.89%，成为主要优势属。检测到除氮菌Desulfomicrobium（3.69%）和Cupriavidus（0.58%）的丰度分别升高至5.41%和4.69%。反硝化细菌Bacillus（8.24%）和Rhodopseudomonas（4.37%）的丰度分别降低至2.12%和0.12%，Acinetobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Thermomonas和Thiobacillus的丰度由0.34%、0.14%、0.33%、0.03%和0.18%分别升高至16.69%、10.44%、3.09%、5.81%和2.83%，其中Acinetobacter、Pseudomonas和Bacillus也是常见的除磷菌。系统中存在丰富的功能微生物属，对常规污染物有良好的去除效果，且SM2在不同程度上影响着细菌结构。
投加SM2后，A系统经短暂波动后即达到平稳、高效的运行状态。经分析，系统的上、中两层微生物的Chao1指数分别为3533.06和2706.69，仍然维持了较高的微生物丰度。实验中检测到影响抗生素去除的微生物属包括Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等，其丰度均有显著增加，这些耐药菌是去除抗生素的优势菌属，可以直接破坏和修饰抗生素使其失活。推测其原因很可能是铁碳微电解有效降解了磺胺类抗生素，导致对微生物种群的胁迫效应下降，低浓度的SM2和铁碳微电解作用刺激了功能微生物的活性，促进以Cloacibacterium为代表的菌属生长，使A系统中微生物群落结构得到适应性调整和二次驯化。经过该过程，A系统中再次形成了丰富的功能菌属，并能够维持对污染物的有效去除，保证系统稳定运行。
投加SM2前，B系统的主要优势菌属分别为Chlorobaculum和Chlorobium。投加SM2后，B系统中主要优势属Chlorobaculum（10.93%）和Chlorobium（29.53%）的丰度分别降低至3.89%和0.58%，而Trichococcus和Halomonas的丰度分别由2.54%和0.13%升高至7.14%和11.21%，成为新的主要优势菌属。脱氮菌Chlorobium的丰度降低了28.95%。反硝化细菌Hydrogenophaga的丰度（2.29%）升高至2.31%，硝化细菌Azospira的丰度由0.28%增加至2.30%。与抗生素去除有关的微生物Lysobacter的丰度由0.11%升高至5.12%。
投加SM2后，B系统去除常规污染物时产生了大幅度波动，去除效果下降明显。该系统上、中两层微生物的Chao1指数分别由3695.20和3704.07降低至3054.57和1199.88，总体微生物量明显下降。在B系统中也仅发现了一种与抗生素去除有关的优势菌属（Lysobacter），表明在高浓度SM2的胁迫下，该系统受到显著冲击，难以进行微生物群落结构的适应性调整，因此B系统的稳定性及对污染物的去除效果均大幅度下降。
3、结论
①在SM2的胁迫下，微电解耦合上升垂直流人工湿地系统仍能维持稳定、高效的运行状态，对常规污染物与SM2均表现出了更好的去除效果，而普通上升垂直流人工湿地系统难以实现稳定运行，其对常规污染物与SM2的去除效果均显著低于微电解耦合上升垂直流人工湿地系统。
②基质酶活性的变化情况表明，微电解耦合上升垂直流人工湿地系统中脲酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性的变化率显著低于普通上升垂直流人工湿地系统。主要原因是微电解耦合上升垂直流人工湿地系统中铁碳微电解作用降低了SM2对系统的毒性胁迫，有效维持了基质酶的活性，而普通上升垂直流人工湿地系统受到较高浓度SM2的冲击，微生物种群受到较大程度的影响，脲酶、碱性磷酸酶和脱氢酶活性大幅度降低。
③铁碳微电解对SM2的分解作用降低了胁迫效应，较低浓度的SM2可能促使微生物属发生二次驯化，致使去除抗生素的微生物属Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等的丰度均显著增加，群落结构的适应性调整保证了微电解耦合上升垂直流人工湿地系统稳定、高效的运行状态；普通上升垂直流人工湿地系统在高浓度SM2的胁迫下，难以实现微生物结构适应性调整和二次驯化，对污染物的去除效果明显下降。（来源：广西师范大学环境与资源学院，珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，桂林电子科技大学生命与环境科学学院）
