厌氧氨氧化-羟基磷灰石（Anammox-HAP）耦合工艺是一种将Anammox和诱导结晶相结合的污水处理方法，它首先通过“生物诱导矿化”的方式将污水中的PO43-和Ca2+结合成羟基磷灰石，然后使HAP与厌氧氨氧化菌（AnAOB）结合成AnammoxHAP，从而实现同步脱氮除磷的目的。此外，AnAOB在耦合体形成过程中可分泌胞外聚合物（EPS）等内源有机质，该物质可起到桥梁作用将生物质与HAP黏结到一起，进一步促进了耦合体的形成。Anammox-HAP耦合工艺既可实现同步脱氮除磷的目的，又可将磷酸盐（PO43--P）以HAP的形式储存在剩余污泥中，最终实现磷的回收和利用。
温度是影响厌氧氨氧化工艺的重要因素之一，保持适宜的温度对微生物的生长和新陈代谢至关重要。温度降低会抑制AnAOB的生长，使其丰度下降，进而影响工艺的脱氮性能，因此，控制合适的温度有利于Anammox反应器高效、稳定地运行。研究表明，Anammox反应的最适温度为30~40℃，然而，由于污水温度的季节性变化，大多数地区的污水温度低于25℃，对于高纬度地区，污水温度通常在10℃以下，若不对污水温度加以控制，很难达到Anammox反应的最适温度，从而导致其脱氮性能下降。
研究者考察了中低温条件下不同反应器中Anammox的性能，DeAlmeida等人发现，当温度为35℃或25℃时，SBR反应器对NH4+-N和NO2--N的去除率高达96%，而在20℃时去除率虽出现下降，但依然可保持在90%左右；Ye等人发现，28℃时，对生物膜载体进行预曝气有利于提高厌氧附着膜膨胀床（AAFEB）反应器的脱氮性能；Dosta等人在18~30℃下成功运行了SBR反应器，但当温度降至15℃时，NO2--N开始大量积累，Anammox脱氮能力明显下降；Wang等人也有类似发现，当水温由35℃降至15℃时，UASB反应器出水中的NO2--N浓度突然增加。Zhu等人认为，Anammox反应的最佳温度为26~28℃，当温度高于40℃或低于15℃时都会抑制AnAOB的代谢速率。但目前对于Anammox-HAP系统在中低温下的运行性能了解不多，限制了该工艺的应用和推广。
为此，采用AAFEB反应器考察了AnammoxHAP系统在中低温条件下的脱氮除磷性能，同时分析污泥粒径、EPS和微生物菌群结构变化，研究中低温对系统脱氮性能的影响及机制，评估了反应器不同位置的AnAOB富集情况，以期为该耦合工艺的实际应用提供指导。
1、材料与方法
1.1 实验装置与运行策略
接种污泥取自实验室稳定运行的AAFEB反应器，运行温度为35℃，水力停留时间（HRT）为3h，颗粒污泥呈红褐色。实验采用一个总容积为10L、有效容积为6.28L、内径为10cm的AAFEB反应器（见图1），反应器内为Anammox-HAP系统，已经在（30±1）℃下稳定运行了110d。反应器采用有机玻璃制作。整个系统除了AAFEB反应器外，还设有进水桶、出水桶、恒温箱、蠕动泵和湿式气体流量计等设备。模拟污水从反应器底部进入，经过充分反应后从顶端的出水口排出。
反应器主体部分设有恒温层，通过恒温箱控制反应器内污水温度。表1为反应器的运行阶段和进水特性，共分为4个阶段。阶段Ⅰ~Ⅳ的温度逐渐降低，HRT保持3h不变，pH维持在7.5~8.5之间。
1.2 原水水质
反应器采用人工模拟污水，分别由（NH4）2SO4、NaNO2和KH2PO4提供NH4+-N、NO2--N和PO43--P，其中，NH4+-N与NO2--N物质的量之比为1∶1.32；此外，还投加了NaHCO（31.26g/L）、CaCl2‧2H2O（0.45g/L）、KCl（0.57g/L）和MgSO4‧7H2O（0.2g/L）。
在配制污水时，还投加了微量元素Ⅰ和Ⅱ，投加量均为1mL/L。其中，微量元素Ⅰ包括：EDTA（5g/L）、FeSO4‧7H2O（5g/L）；微量元素Ⅱ包括：EDTA（15g/L）、ZnSO4‧7H2O（0.43g/L）、CoCl2‧2H2O（0.24g/L）、MnCl2‧4H2O（0.99g/L）、CuSO4‧2H2O（0.25g/L）、NiCl2‧3H2O（0.19g/L）、NaSeO4‧10H2O（0.21g/L）、H3BO（30.014g/L）、NaMoO4‧2H2O（0.22g/L）。
1.3 检测指标与分析方法
每天取1次反应器进出水，采用标准方法检测NO3--N、NH4+-N、NO2--N和PO43--P。通过加热称重法和马福炉燃烧减重法检测混合液悬浮固体浓度（SS）和混合液挥发性悬浮固体浓度（VSS）。采用“加热法”提取污泥中的EPS，然后分别通过苯酚-硫酸法和Folin-酚法检测多糖和蛋白质含量。同时，通过Mastersizer2000型激光粒度仪对Anammox颗粒污泥的粒径分布进行测定。总氮容积负荷（NLR）、总氮去除负荷（NRR）和总氮去除率（NRE）由进出水TN浓度等通过计算得到。
利用高通量测序技术对AAFEB反应器内微生物的菌群变化进行分析。对细菌的16SrRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增，引物序列为341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。在97%的相似水平下对所有序列进行OTUs划分，并进行统计分析。测序是在上海生工生物工程股份有限公司的IlluminaMiSeqPE300平台上进行的。
2、结果与讨论
2.1 温度降低过程中系统的脱氮除磷情况
在降温过程中，Anammox-HAP耦合工艺脱氮除磷性能的变化见图2。在阶段Ⅰ控制系统温度为30℃，在NRE保持相对稳定下，每10d改变进水NH4+-N浓度，进水NH4+-N浓度的提高导致NLR由最初的（2.30±0.07）kg/（m3·d）增至（3.58±0.08）kg/（m3·d）。此阶段对氮的去除效果较好，NRE基本维持在80%~85%之间，NRR最高可达（2.95±0.09）kg/（m3·d），表明AnAOB的活性较高。
在阶段Ⅱ，保持进水氮浓度不变，水温由30℃降低至25℃。降温对系统脱氮性能产生了一定的影响，NRE虽然保持在75%以上，但与阶段Ⅰ相比，NRR由（2.95±0.09）kg/（m3·d）降低至（2.69±0.14）kg/（m3·d），说明当水温由30℃降为25℃时，AnAOB活性受温度变化影响较小。然而，降温对磷的去除效果影响较大，去除率由之前的75%左右降至50%左右，说明HAP的形成受降温的影响较大，25℃不利于该系统除磷。
在阶段Ⅲ水温降至20℃后，反应器对氮的去除效果明显变差，与阶段Ⅱ相比，NRE与NRR均明显下降，分别降至65%和（2.25±0.07）kg/（m3·d）。表明低温抑制了AnAOB的活性，导致Anammox脱氮能力降低，反应器出水NH4+-N、NO2--N浓度分别为50和80mg/L左右，均出现了积累。有研究发现，高浓度的NH4+-N和NO2--N对微生物有毒害作用，分别会以游离氨（FA）和游离亚硝酸（FNA）的形式抑制AnAOB的活性，特别是FNA对Anammox反应的抑制更为显著。因此，经过15d的运行后，主动降低进水基质（NH4+-N和NO2- N）浓度，以防止FA和FNA太高而对系统造成严重影响。然而，系统脱氮性能并没有得到明显改善。为进一步缓解高浓度基质给系统带来的不利影响，6d后将进水NH4+-N浓度由150mg/L下降至120mg/L，NO2--N浓度也按比例降低。稳定运行一段时间后，系统NRE提高，但其脱氮效率仍然低于降温前。同时，由于进水氮浓度的降低导致系统的NRR明显下降，由之前的（2.25±0.07）kg/（m3·d）降至（1.61±0.07）kg/（m3·d）。在阶段Ⅲ后期，继续降低进水基质浓度，NO2--N积累的问题得到一定程度缓解。
在阶段Ⅳ降低温度至15℃，系统脱氮能力继续下降，NRE在短时间内由之前的65%降至50%。同时，NRR由之前的（1.61±0.07）kg/（m3·d）降低至（1.14±0.02）kg/（m3·d）。且系统脱氮性能在反应器连续运行4d后并未明显改善。此时，反应器出水中的氮浓度明显上升，因此进一步降低进水NH4+-N至50mg/L，NO2--N降低至66mg/L。在进水氮浓度降低后，系统的脱氮性能先是出现短暂的回升，而后又下降至55%左右，且稳定了一段时间。在第117天时，系统的氮去除性能突然恶化，NRE由前一天的55%下降至38%，而后在第118天时下降至23%，NRR由之前的（0.56±0.05）kg/（m3·d）降低至（0.23±0.06）kg/（m3·d）。说明AnAOB的活性受到严重抑制，系统脱氮性能恶化。温度的降低对系统除磷性能的影响也很大，当水温降至15℃时，出水磷浓度不断上升，去除率由阶段Ⅳ初期的48.4%逐渐降低至15.9%。在较低温度下，结晶反应的饱和指数下降，导致HAP的形成更加困难，说明生物诱导结晶法除磷在15℃下受限。
2.2 降温过程中污泥特性的变化
EPS是一种由微生物分泌且通常位于细胞表面的生物聚合物，其成分较为复杂，主要包含多糖（PS）、蛋白质（PN）、腐殖酸、核酸和脂质等物质，其中PS和PN占主要部分。图3为系统降温过程中微生物分泌的EPS总量和组成的变化情况。当温度为20~30℃时，微生物分泌的EPS总量差别不大，基本维持在90mg/gVSS上下。
产量较高的EPS可降低Anammox颗粒污泥的孔隙率和渗透率，有利于微生物的聚集，从而缓解低温对微生物活性的不利影响。与PS相比，PN中含有更多带负电荷的氨基酸，该物质更容易与多价阳离子发生静电结合，因此，PN更有利于提高细菌聚集体结构的稳定性。而存在于菌胶团细胞间隙中的PS不仅有利于微生物的聚集，还有利于保持颗粒污泥结构的完整性。
当温度降至15℃时，由于AnAOB的活性受到明显的抑制，EPS产量显著降低，由之前的96.79mg/gVSS降为67.10mg/gVSS。EPS产量的降低不利于颗粒污泥生长，也不利于Anammox系统稳定高效地脱氮。此外，PN是疏水性物质，而PS是亲水性物质，PN/PS常用来表征污泥表面的疏水性，同时对维持微生物群落结构的完整性具有重要作用。研究表明，较大的PN/PS值有助于促进污泥颗粒化，故当温度为25~30℃时更有利于形成颗粒污泥。
对AAFEB反应器内不同高度的污泥平均粒径进行了分析，结果如图4所示。在Anammox-HAP耦合脱氮除磷系统中，耦合体主要是由AnAOB和HAP结合而成，而HAP的密度较大，沉降性较好，大多数HAP位于反应器的底部；同时，由于AAFEB反应器采用“底部进水”方式，中部、底部污泥因最先与基质接触而保持了较高的活性，从而分泌了更多的EPS。因此，中部和底部污泥的粒径最大。
一般认为，EPS可增强颗粒污泥结构的稳定性，还充当微生物和HAP的“桥梁”，将AnAOB和HAP黏结起来，这有利于颗粒污泥的形成和平均粒径的增大。由于中部和底部污泥中存在大量的HAP，且AnAOB活性较高，分泌的EPS更多，AnAOB和HAP在“生物诱导矿化”和“生物控制矿化”的共同作用下不断聚集成团，从而使中部和底部的污泥拥有更大的平均粒径；而上部的污泥由于得不到充足的HAP和EPS，因此平均粒径较小。
对比不同温度下的污泥平均粒径可以发现，30℃下不同高度污泥的平均粒径均较大，且该温度下前后期颗粒污泥平均粒径较为稳定；当温度降至25℃时，污泥粒径由于突然的降温而减小，但随着反应器的稳定运行，微生物对温度逐渐适应，污泥的平均粒径逐渐恢复至降温前的水平；当温度降为20℃时，污泥平均粒径的变化趋势与25℃时类似，先减小后增大；当温度降为15℃时，AnAOB的活性受到抑制，EPS产量明显减少，部分颗粒污泥因得不到充足的EPS而发生解体，且即使稳定运行一段时间也无法使粒径增大。
分别在第10天（30℃末）和第120天（15℃末）从反应器中取出不同高度的Anammox污泥，通过培养皿和刻度尺观察其形态，结果表明，30℃时的污泥粒径普遍较大，颗粒状较为明显；当温度降为15℃且运行一段时间后，部分颗粒污泥发生解体，粒径明显减小。这表明，降温会导致EPS产量降低，进而影响污泥颗粒稳定性。
2.3 微生物菌群分析
通过高通量测序技术，对不同温度下的微生物菌群结构进行检测。待测污泥样本共有9份，取自不同温度、不同高度的Anammox污泥样本分别命名为：S-25、Z-25、D-25、S-20、Z-20、D-20、S-15、Z-15和D-15，其中，S、Z和D分别代表上部、中部和底部，数字代表温度。污泥中微生物的序列数、Alpha多样性指标的测试结果如表2所示。
Coverage反映的是待测样品中的微生物在样品文库中所占的比例，该值越大则数据的可信度越高。由于9个污泥样本的Coverage值均超过99.5%，因此，样本序列的被测出概率较高，测序结果完全可以反映污泥样本中微生物的真实状况。Simpson和Shannon指数被用来表示微生物菌群的多样性，一般来说，Simpson指数越大或Shannon指数越小，表明种群多样性越低。由表2可知，在降温过程中，反应器内同一高度污泥的微生物多样性呈现先降低后增加的趋势，说明虽然低温会抑制微生物活性，但微生物对低温的适应能力也在逐渐增强。此外，Ace和Chao指数可表示微生物的相对丰度，在同一温度下，底部污泥中微生物的相对丰度最高。
图5显示了在不同温度下属水平微生物的群落组成和相对丰度。共检测到4种AnAOB，其中unclassified_Candidatus_Brocadiaceae的相对丰度最高，在25℃时，该菌在不同高度污泥中的相对丰度略有差别，从上往下依次为14.6%、15.1%和7.7%。与其他AnAOB属相比，Candidatus_Anammoxoglobus的相对丰度最低，几乎检测不到。当温度由25℃降低至15℃时，unclassified_Candidatus_Brocadiaceae作为优势菌，其相对丰度减少，是导致系统脱氮性能不断下降的原因之一。在降温期间，与Candidatus_Brocadia相比，Candidatus_Kuenenia的相对丰度基本呈现不断上升的趋势，说明该菌对低温的耐受能力更强。同时还注意到，底部污泥中Candidatus_Kuenenia的相对丰度随温度的降低而上升，而上部污泥则呈现相反的变化趋势，说明在低温环境下，反应器底部更利于Candidatus_Kuenenia的生长和繁殖。并且高通量测序发现，污泥中存在少量的氨氧化菌（AOB），该菌对脱氮也做出一定的贡献。
3、结论
①当水温从30℃梯级降低到15℃过程中，系统脱氮除磷性能均降低。NRR由30℃时的最高值（2.95±0.09）kg/（m3·d）降低至15℃时的最低值（0.23±0.06）kg/（m3·d）；除磷率由75%降至20%。特别是降温至15℃后，Anammox-HAP耦合工艺的脱氮除磷性能显著降低，温度低于15℃不利于该系统脱氮除磷。
②温度是影响污泥粒径的重要因素之一，当系统温度≥20℃时，温度突然降低会导致AnammoxHAP颗粒污泥粒径在短时间内变小，但颗粒污泥对低温表现出来一定的耐受性，随着系统的稳定运行，其平均粒径会逐渐恢复至降温前水平。然而，当温度降至15℃时，系统脱氮性能在短时间内发生明显恶化，EPS含量降低，颗粒污泥出现解体。
③在Anammox-HAP耦合系统中，AnAOB是主要的脱氮功能菌。其中，unclassified_Candidatus_Brocadiaceae的相对丰度最高可达15.1%，是耦合系统中的优势AnAOB属。与Candidatus_Brocadia相比，Candidatus_Kuenenia对低温的耐受能力更强，且当环境温度较低时，Candidatus_Kuenenia更倾向于在反应器底部生存和繁殖。（来源：天津城建大学环境与市政工程学院，天津市水质科学与技术重点实验室，河北泛亚工程设计有限公司华北分公司）
