好氧颗粒污泥（AGS）技术起源于20世纪90年代，被认为是最具发展前景的污水处理工艺之一。与传统活性污泥相比，AGS具有规则的形态、紧实的结构、良好的沉降性能以及高浓度生物量，能承受高强度的有机有毒废水冲击。碳氮负荷及其比值（C/N）是影响AGS形成和稳定运行的重要因素。一般来说，较高的C/N（7.5~30）有利于异养菌快速生长，形成蓬松絮体和大颗粒；而较低的C/N（2~5）则会形成以慢速生长菌为主的稳定致密小颗粒。Luo等人研究发现C/N由4降至1时，AGS的物理特性、硝化性能和胞外聚合物（EPS）含量均会下降，微生物群落发生显著变化，进而导致颗粒解体。在实际应用中存在着大量低C/N同时碳氮负荷波动大的废水，如药厂、垃圾填埋场、化肥厂和石化行业废水等，利用好氧颗粒污泥技术处理该类废水还需进一步深入实践。
目前有研究提出通过调整操作条件，在系统进入曝气阶段前设置前置缺氧段来提高碳源不足时的反硝化效率。同时，颗粒内部能够形成缺氧层，定植更多反硝化菌，提高好氧颗粒污泥系统的稳定性。Kocaturk等人研究发现，在曝气前引入缺氧段能够通过改变C/N调节硝化菌及异养菌之间的种群分布，在C/N为7.5的条件下好氧颗粒污泥对COD的去除率可达75%~90%，TN去除率高达90%以上。Chen等人通过交替厌氧/好氧结合分步进水模式，在C/N为5和3的条件下，均能实现超过90%的氮去除效率。值得注意的是，缺氧段的泥水混合效果会影响AGS特性和污染物去除效率。但目前关于缺氧段泥水混合程度对AGS稳定性影响的研究结果不一致，因此，缺氧段泥水混合效果对AGS的影响机理还需进一步探究。
基于此，接种好氧颗粒污泥后处理不同C/N的废水，通过在缺氧段施加和不施加外循环操作，考察AGS长期运行过程中污泥形态特征、污染物去除性能、EPS含量和组成、微生物菌落结构的变化，探究系统缺氧段混合效果对AGS稳定性的影响机理，以期为好氧颗粒污泥技术的应用提供参考。
1、材料与方法
1.1 实验材料
接种好氧颗粒污泥是在低C/N（碳氮负荷为400/100mg/L）下培养并冷藏放置近6个月的颗粒污泥，MLSS为2.61g/L，MLVSS为2.41g/L，污泥体积指数（SVI30）为100mL/g。
1.2 实验装置与操作条件
实验采用圆柱形有机玻璃材质SBR反应器，内径为5cm，有效高度为100cm，有效高径比（H/D）为20，有效工作体积为2L。反应器从底部进水，中部排水，体积交换率为50%。每周期为4h，每天运行6个周期。单周期运行方式为进水5min、缺氧55min、曝气170min、沉降5min、排水5min，由时间控制开关自动控制。在好氧段，由设置在反应器底部的曝气石曝气，曝气流量控制在1.2L/min（即表面气速约为1cm/s），水力停留时间（HRT）为8h。缺氧段开启外循环操作时，使用蠕动泵将反应器上层废水通过外部软管输送至反应器底部。蠕动泵流量控制在60mL/min，使颗粒污泥层膨胀高度控制在一定范围，避免颗粒污泥扬起被循环带走。
1.3 废水水质
系统进水为人工模拟废水。碳源为含量60%的工业乙酸钠，氮源为硫酸铵，磷源为磷酸二氢钾，通过投加碳酸氢钠调控pH在7.5左右。其他的营养液和微量元素包括：KH2PO4为22.5mg/L，CaCl2·2H2O为12.5mg/L，MgSO4·7H2O为15mg/L，FeSO4·7H2O为10mg/L，MnCl2·4H2O为0.12mg/L，ZnSO4·7H2O为0.12mg/L，CuSO4·5H2O为0.03mg/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O为0.05mg/L，NiCl2·6H2O为0.1mg/L，CoCl2·6H2O为0.1mg/L，AlCl3·6H2O为0.05mg/L，H3BO3为0.05mg/L。不同时期的进水碳氮负荷提升情况如表1所示。
1.4 分析项目与测试方法
COD、氨氮、亚硝态氮、硝态氮采用哈希DR3900紫外可见光度计测定。SVI、MLSS、MLVSS等按照美国APHA标准方法进行测定。好氧颗粒污泥的表观形态采用奥林巴斯XTL-300型光学显微镜观察，颗粒粒径使用马尔文2000型激光粒度仪测定。
胞外聚合物（EPS）分为疏松层EPS（LB-EPS）和紧密层EPS（TB-EPS），采用水热提取法分别提取。EPS含量为蛋白质（PN）和多糖（PS）含量之和，PN采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白为标准样品；PS采用蒽酮-硫酸比色法测定，以葡萄糖为标准样品。
1.5 颗粒污泥微生物群落分析
在系统运行的不同时间段取出污泥样品20mL，于8000r/min离心15min后收集沉淀污泥，保存于-80℃冰箱中备用。使用PowerSoil®DNA分离试剂盒提取样本DNA，以Qubit2.0DNA试剂盒测量其纯度和浓度。使用27F/1492R引物组对细菌16SrDNA基因的V1-V9区进行扩增，将最终的反应产物进行AMpurePBBeads纯化后置于SequelⅡ测序仪上进行上机测序。以Silva为参考数据库，使用朴素贝叶斯分类器对OTUs代表序列进行分类学注释，得到物种分类学信息，统计样本在不同分类水平上的群落结构。利用QIIME软件计算各样品的Ace、Chao1及Shannon指数。
2、结果与讨论
2.1 好氧颗粒污泥特性
2.1.1 好氧颗粒污泥的形态特征
图1是不同时期污泥的电镜照片（除接种污泥和第220天的图像比例尺为1倍，其余图像皆为5倍）。接种时好氧颗粒污泥呈黄褐色，表观结构相对完整，说明冷藏储存对颗粒的物理结构完整性影响不大。在阶段Ⅱ碳氮负荷提升至400/50mg/L时，颗粒形态结构依然能够维持。在阶段Ⅲ提升碳氮负荷至400/80mg/L，缺氧段开始加入外循环操作，此时系统内开始出现絮体与颗粒共存状态。这种现象可以解释为外循环操作提高了缺氧段的反硝化作用，上一周期残留的硝态氮还原产生的气态氮，对颗粒结构造成了一定的冲击，导致颗粒结构分散，颗粒表面出现一定的絮体细菌。尽管如此，好氧颗粒污泥的沉降性能并没有受到明显影响。说明此时的AGS已较好地适应了高氨氮环境，微生物群落已趋于稳定。在阶段Ⅳ提升碳氮负荷至400/100mg/L，污泥形态以絮体和粒径较小的颗粒为主，系统的沉降性能产生剧烈波动。这主要是因为进水氨氮负荷进一步提升，致使反硝化过程产生了更多的气态氮，对原有颗粒结构造成了更为严重的冲击，部分颗粒发生了破碎。但是，此阶段并没有观察到丝状菌生长，说明好氧颗粒仅物理结构受到影响，而其稳定性受到的影响不大。在阶段Ⅴ提升碳氮负荷至600/150mg/L，并且缺氧段停止了外循环操作，系统内开始形成明显的大颗粒污泥，同时颗粒的密实程度显著下降，稳定性受到冲击。在第220天，由于好氧颗粒沉降性能和氨氮去除性能恶化等原因，系统终止运行。
2.1.2 好氧颗粒污泥浓度和沉降性能
系统污泥浓度随时间的变化如图2（a）所示。在阶段Ⅰ，MLSS在第16天降至最低2.27g/L，MLVSS在第19天降至最低1.71g/L，MLVSS/MLSS降至0.69。这是因为低温长期储存的颗粒污泥结构疏松，刚加入到系统时，活性低、沉降性能差的污泥被大量排出系统。污泥活性逐渐回升之后，污泥浓度也随之提高，在阶段Ⅱ末MLSS和MLVSS分别达到3.78和3.10g/L，MLVSS/MLSS提升至0.82。进入到阶段Ⅲ和Ⅳ后，由于施加外循环的缺氧段混合效果大大提高，系统反硝化效果提升而产生的大量气态氮黏附在颗粒污泥上，导致污泥沉降性能下降，外排流失，MLSS、MLVSS随之明显下降，最低降至1.44和0.68g/L，MLVSS/MLSS最低降至0.47。之后，系统逐渐适应较高的进水氨氮负荷条件，MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS在阶段Ⅳ的中后期开始增长。进入到阶段Ⅴ后，由于关闭缺氧段外循环，MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS呈现出先稳定后上升再急剧下降状态。这种现象可以解释为：经过前阶段长期运行后，颗粒污泥已经具有较强的物理和生物结构，所以在该阶段初期，虽然外循环停止，系统的MLSS、MLVSS仍能维持相对稳定。但是，后期由于污泥长期处于高碳氮负荷且缺氧条件不佳，其菌群结构受到极大影响，稳定性逐渐变差并大量排出系统，最终导致MLSS、MLVSS降低。
反应器的SVI30和SVI30/SVI5随时间的变化如图2（b）所示。在阶段Ⅰ反应器的SVI30由100mL/g逐步下降，在第23天降至60mL/g，说明冷藏颗粒污泥沉降性能恢复较快。在阶段Ⅱ，反应器的平均SVI30基本维持在53mL/g左右。在阶段Ⅲ和Ⅳ添加了外循环操作后，反硝化过程产生的大量气态氮对污泥沉降性能造成影响，尤其是阶段Ⅳ的SVI30在100~200mL/g之间波动。在阶段Ⅴ，系统SVI30由100mL/g增加至170mL/g。从系统启动到阶段Ⅲ结束SVI30/SVI5都稳定在1左右，这表明系统颗粒污泥一直处于颗粒完全形成的状态。在阶段Ⅳ和阶段Ⅴ，SVI30变化导致SVI30/SVI5波动，此时颗粒污泥形态发生剧烈变化，沉降性能恶化，颗粒结构瓦解。
2.1.3 好氧颗粒污泥的粒径分布
好氧颗粒污泥的粒径分布曲线见图3。接种颗粒污泥的平均粒径为672μm。这是因为在4℃低温下存储时，颗粒污泥长期处于饥饿状态，颗粒内部的EPS被当作营养物质消耗，使得颗粒间的黏结性能下降，开始向四周扩散所致。启动运行之后，颗粒的粒径逐渐减小，在阶段Ⅱ末测得平均粒径为206μm，此时系统内主要为细小的颗粒。在阶段Ⅲ和Ⅳ加入外循环后，平均粒径减小至144μm，这主要归因于前置缺氧段进行的反硝化作用产生的气态氮冲击，导致颗粒结构破碎。在阶段Ⅴ颗粒逐渐向蓬松态转变，颗粒粒径增大至791μm。
2.2 好氧颗粒污泥的污染物去除性能
2.2.1 COD去除性能
运行期间AGS对COD的去除效果见图4。
在阶段Ⅰ初期，反应器对COD的去除效果并不理想，特别是第16天去除率最低至68%。说明冷藏后的颗粒污泥活性较低，需要一定恢复周期。随着污泥活性的逐步恢复，至该阶段末COD去除率提升至90%。在阶段Ⅱ~Ⅴ，好氧颗粒污泥始终保持良好的COD去除性能，去除率均达到了95%以上。这表明碳氮负荷的提升和缺氧段是否设置外循环对系统去除COD影响不大。
2.2.2 NH4+-N去除性能
系统对氨氮的去除性能如图5所示。在阶段Ⅰ系统对NH4+-N的去除率较低，这与冷藏颗粒污泥的硝化菌活性低有关。至该阶段末期，硝化菌的活性完全恢复，NH4+-N去除率达到了98%。在阶段Ⅱ虽然提升了碳氮负荷，但是碳氮比仍处于比较适宜颗粒污泥生长的范围，因此NH4+-N去除率达到了99%以上。在阶段Ⅲ再次提高NH4+-N负荷至80mg/L，C/N为5，NH4+-N的去除率仍能达到99%以上。这可能是因为启动了外循环装置，系统在前置缺氧段进行了充分泥水混合，使得反硝化菌与硝化菌活性都较高。在阶段Ⅳ，NH4+-N负荷进一步增加至100mg/L时，在初期和中期氨氮去除率有几次波动，但大部分情况下都维持在99%。表明好氧颗粒污泥在该负荷冲击下具有良好的适应性，而去除率波动可能与污泥沉淀性能下降导致的浓度降低有关。在阶段Ⅴ系统负荷进一步增加至600/150mg/L，同时缺氧段停止了外循环。在该阶段初期，基于好氧颗粒在前阶段获得的较高硝化活性，使得系统的NH4+-N平均去除率维持在99%以上。但运行近3周后去除率迅速下降，在第193天降至77.54%，运行末期降至33.87%。
2.2.3 TN去除性能
在阶段Ⅰ，NO2--N产生一定累积，产生的NO3--N少，导致TN去除率很低。表明此时的系统完全硝化能力较差。系统运行至阶段Ⅰ末，虽然氨氮负荷增加，但NO2--N降低至1mg/L，NO3--N浓度升至30.8mg/L，TN平均去除率逐渐提升至21%。说明硝化菌活性恢复，系统反硝化能力有所增强。在阶段Ⅲ开始增加外循环操作后，虽然氨氮负荷大幅提升至80mg/L，TN去除率在前期波动后不但没有降低，反而提升至30%。在阶段Ⅳ进一步提升氨氮负荷，TN去除率进一步提升至57%。在阶段Ⅲ和Ⅳ，NO2--N基本没有积累，说明增加外循环可以使好氧颗粒污泥在前置缺氧段有效进行反硝化反应，提高了对TN的去除率。在阶段Ⅴ碳氮负荷进一步增加至600/150mg/L时，由于取消了外循环，NO2--N达到了19.6mg/L，反硝化效率大大降低，在后期去除率急剧下降至5%。
2.3 胞外聚合物含量分析
胞外聚合物对于微生物聚集、好氧颗粒污泥的形成和结构稳定均具有重要作用。经过长期的冷藏存储好氧颗粒污泥中的PN会作为能源物质被消耗，其浓度逐渐下降。在培养过程中，在LB-EPS中始终没有检测到PN，PS含量则由接种时的0.62mg/g降至第二阶段结束时的0.11mg/g（第61天）。而后在阶段Ⅳ和Ⅴ多糖含量持续增加，在第155天和第219天分别达到2.02、5.91mg/g。这可能是由于在阶段Ⅳ好氧颗粒污泥为对抗施加外循环后产生的过量含氮气体冲击，分泌更多的PS来维持自身稳定；而在阶段Ⅴ停止外循环操作后颗粒结构被破坏。此现象说明好氧颗粒结构不稳定时，可能会大量分泌LB-EPS帮助颗粒恢复结构。同时，可以推测高碳氮负荷下停止外循环会弱化颗粒结构，导致LB-EPS大量分泌。
B-EPS大量分泌。对于TB-EPS而言，0、61、155、219d的PS含量分别为12.55、15.21、16.10、12.65mg/g，PN含量为4.02、12.76、18.15、19.47mg/g，对应的PN/PS为0.32、0.84、1.13、1.54。可见，接种污泥的EPS内层PN含量也处于较低水平，而在阶段Ⅲ~Ⅴ其含量逐步增加。据报道，TB-EPS中的PN与颗粒的疏水性直接相关，是维持颗粒结构稳定的重要因素。由此可知，好氧颗粒污泥受到冲击时可能会在TBEPS中产生大量PN。同时，TB-EPS中的PS含量始终维持在较高水平。Tay等认为TB-EPS中β-多糖可提高微生物间的黏附力，强化AGS结构稳定性。因此TB-EPS中的PS可能在颗粒结构不稳定时对维持好氧颗粒污泥自身稳定也起到重要作用。Martinez等认为，高PN/PS的颗粒沉降性能较差，而较低的PN/PS则有利于改善细胞表面的疏水性，使得AGS趋于稳定。在阶段Ⅲ~Ⅴ，紧密层的PN/PS呈逐渐上升趋势，这主要是由于其PN含量快速增加所致。随着PN/PS的升高，颗粒的沉淀性能在这三个阶段逐渐变差。不过，在阶段Ⅲ和Ⅳ，虽然沉淀性能有所下降，但颗粒结构并未受到明显影响。然而到了阶段Ⅴ，由于外循环操作停止，颗粒稳定性出现变差的情况。
2.4 好氧颗粒污泥的微生物群落结构变化
2.4.1 微生物群落的多样性
系统微生物在不同碳氮负荷下的α多样性指数见表2。OTUs是微生物样品序列按照序列间的距离进行聚类分析的结果，用来指示特定微生物群落中的不同种类或分类单元。由表2可知，接种颗粒污泥的OTUs为121，在阶段Ⅰ降至101，可能是系统中沉降性能差的污泥絮体携带出系统所致。此后，在阶段Ⅱ至阶段Ⅳ前期，OTUs都维持在较低水平。在阶段Ⅳ后期OTUs增加至127，说明缺氧段增加外循环操作可以在一定程度上提高微生物种类数量。在阶段Ⅴ末期，系统OTUs降至111，说明细菌群落种类数量降低。
Chao1、Ace指数代表微生物群落的丰富度，数值越大表示其物种总数越多。好氧颗粒污泥的Chao1和Ace变化趋势基本与OTUs一致。Shannon指数是一种衡量生物群落多样性的统计指标，其值越大则微生物多样性越高。由表2可知，接种好氧颗粒污泥的微生物多样性最高，在投入系统后，先逐渐下降后又有所回升。这表明好氧颗粒污泥中的微生物在经过淘汰筛选并逐渐适应环境后，多样性大大增加。在阶段Ⅴ系统虽然开始崩溃，但颗粒微生物的多样性并没有明显下降。这说明仅通过生物多样性指标并不能判定颗粒是否完全稳定。
2.4.2 微生物群落结构的演变
不同碳氮负荷下系统门和属水平微生物相对丰度变化见图7。在门水平上，不同碳氮负荷下好氧颗粒污泥微生物的群落组成基本没有变化，均以Proteobacteria（变形菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）为主。有研究表明，Proteobacteria和Bacteroidetes具有较强的COD和氨氮降解能力，两者有利于维持系统良好的处理性能。同时，在接种污泥中还存在Firmicutes（厚壁菌门），Firmicutes中的芽孢杆菌具有抵抗外界有害因子的能力，且能够促进硝化作用及维持系统稳定运行。据报道，Firmicutes很容易受到水力剪切力的影响而排出系统，这是其在运行中丰度大幅下降的原因。
由图7（b）可知，接种好氧颗粒污泥在属水平上的微生物种群较为丰富，基本是以uncultured_bacterium_f_Chitinophagadeae、Rubrivivax（红长命菌属）、Chryseobacterium（金黄杆菌）和Ferruginibacter为主。Chitinophagadeae能分解和利用多糖作为碳和能量来源。Rubrivivax可在黑暗条件下进行化能自养生长，也可利用各种有机化合物进行好氧化能异养生长。Chryseobacterium能在低温环境生长，是一种好氧异养菌，常常伴随着颗粒的不稳定出现。Ferruginibacter为DPAO，能利用硝酸盐作为电子供体，具有厌氧释磷和好氧吸磷的功能。
系统运行13d后，形成了以Dechloromonas（脱氯单胞菌）、Pseudoxanthomonas（假黄单胞菌）为主的细菌群落，同时Thauera（陶厄氏菌）和Pseudomonas（假单胞菌属）开始少量出现。其中，占比最大的Dechloromonas（57%）是一种反硝化聚磷菌，属于慢速生长菌，能够在缺氧环境中利用内部储存的多聚磷酸盐作为能量来源释放磷，并利用硝酸盐作为电子受体进行反硝化。占比第二的假黄单胞菌（16%）是好氧反硝化聚磷菌，能够利用NO3--N和NO2--N进行好氧反硝化。其他少量出现的菌属中，Thauera（3%）是好氧颗粒污泥系统常见菌，属于分泌EPS功能属。它能够在厌氧条件下降解芳香族化合物，并利用细胞内储存的碳源进行反硝化。Pseudomonas（2%）也是典型的反硝化菌，能够进一步将NO3--N和NO2--N转化为气态氮。这些菌属都属于慢速反硝化菌，其占比多可以控制颗粒粒径，使颗粒结构密实，增加稳定性。
在阶段Ⅱ末期（第55天），好氧颗粒结构完全恢复，系统逐渐形成了以Thauera（80%）为主导优势菌属的菌落结构。在阶段Ⅲ和Ⅳ，对反应器施加外循环操作，系统中Thauera仍为绝对优势菌属，但呈现出随着阶段运行占比逐渐降低的趋势。其中，在阶段Ⅳ前期Thauera占比为68%（第100天），后期降为25%（第157天）。而且，随着阶段Ⅳ后期菌属多样性的增加，Rhodobacter（红细菌属）和Dechloromonas成为次优势菌属，占比分别为17%和9%。其中，Rhodobacter是一种反硝化细菌，可以在光照及缺氧条件下进行硝酸盐的还原。由此可以看出，额外施加的外循环使得缺氧段泥水得以充分混合，大大提高了反硝化效率，系统形成以多种慢速生长的反硝化脱氮菌为优势菌属的群落结构，大大提高了好氧颗粒污泥结构和功能的稳定性。
在阶段Ⅴ，AGS结构恶化，主要优势菌属为Thauera、Acidovorax、Chryseobacterium、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas和Rhodobacter。相对于第157天好氧颗粒污泥稳定性较强时期的菌属结构，Thauera和Rhodobacter相对丰度明显降低，占比分别降至16%和4%。这说明关闭外循环后，缺氧环境混合效果的降低抑制了反硝化菌生长，使其丰度降低。与此同时，Acidovorax（16%）和Chryseobacterium（9%）相对丰度明显增加。Acidovorax是颗粒污泥体系中比较常见的乙酰基高丝氨酸内酯（AHLs）产生菌，有助于增加颗粒污泥表面的疏水性，提高颗粒的稳定性。其相对丰度增加可能是颗粒结构变差的应激反应。同时，当好氧颗粒污泥系统出现局部结构破坏或微生物受损时，Chryseobacterium侵入并大量繁殖，进一步加重颗粒污泥的不稳定。在阶段Ⅴ其占比增加，预示着颗粒结构已经被破坏。
3、结论
①设置外循环操作对好氧颗粒污泥的COD去除性能影响不大，但能大大提高对TN的去除性能。
②在受到冲击时，好氧颗粒污泥TB-EPS中的PN和PS含量大量增加，提高了好氧颗粒污泥的疏水性和黏附力，强化了其结构。
③设置外循环操作更有利于慢速生长的缺氧反硝化脱氮菌属的形成和发展，菌落丰富度增加，多样性提高。
④在低碳氮比和较高碳氮负荷条件下通过施加外循操作提高泥水混合效果，可以增强系统反硝化能力，有效维持好氧颗粒污泥的稳定性。（来源：昆明理工大学环境科学与工程学院云南省土壤固碳与污染控制重点实验室）
